Hola! Quiero propagar algunas plantas y tenia algunas dudas a ver si me las puede resolver alguien, las que puedan. 1) A diferencia de la mayoría no tengo una olla a presión para esterilizar pero si tengo una autoclave y un horno de pasteur , como el frasco para esterilizar en autoclave sale como $600 pesos osea unos 40 dolares me compre un vaso de polipropileno sin tapa y tengo una botella de gatorade, que son mas económicos, mi idea era esterilizar ambos pero cuando puse la botella de gatorade no la tape por miedo a que explote y que arruine el autoclave, y lo que paso fue que cuando abrí el autoclave estaba toda pegoteada con el medio de cultivo y se había salido la gran mayoría del medio de adentro de la botella. No lo intente, pero me imagino que con el vaso pasara lo mismo, mi pregunta es si alguien sabe si tapo la botella de gatorade si explotaría adentro de la autoclave y también saber con que puedo tapar el vaso esterilizable para que no se le salga el liquido de adentro y no explote el mismo adentro. 2) Cuando esterilizo los explantes en hipoclorito (9 partes agua 1 hipoclorito) durante 15 minutos, noto que luego de meterlo en el medio de cultivo se les pone la punta blanca lo que me imagino debe ser por la oxidación que produce el hipoclorito. Alguien sabe alguna forma de evitar esto? 3)Alguien usa antibióticos para los medios de cultivo? Cual recomiendan y que tan eficaz son? 4)Que tan eficaz es para evitar la contaminación el uso de la cocina con el extractor prendido y las ornallas encendidas para lograr el cono de esterilidad? Hace falta hacerse una glovebox? 5) Cualquier luz ultravioleta sirve para esterilizar el aire y superficie? esta lo que se llama luz negra que es luz UV pero noto una diferencia de precio enorme con las que venden en los laboratorios para esterilizar y me entro la duda. Bueno por ahora tengo esas!!! Agradezco sus respuestas Saludos
1. Una olla a presión es la versión casera de un autoclave. Así que si disponés de un autoclave, tanto mejor. El horno de Pasteur es similar a meter los frascos en un horno de cocina. Mucha gente esteriliza así. La única precaución es medir en un frasco con agua cuanta se te evapora y ajustar esa cantidad antes de meter los frascos. Lo que se hace para evitar el derrame o la explosión es poner los frascos con la tapa floja. Cuando retiras en caliente, con cuidado de no quemarte, ajustás la tapa (usa una tela porque con la mano te quemás). Las botellas de gatorade están buenas pero te complican un poco el meter los explantos adentro si no tenés mucha experiencia, Conviene usar frascos de boca más ancha, ya que el proceso es más rápido y con menos riesgo de contaminar. 2. La esterilizacion de los explantes es la parte más difícil, ya que es muy dificil esterilizarlos bien. Supongo que usas el protocolo de dejar el explante mínimo 20 min bajo agua corriente, y luego a la solución de hipoclorito. Muchas veces se hace un paso intermedio de sumergirlos en alcohol 96 muy rápido (1 seg) y de ahí al hipoclorito. Si no hacés es paso, agregale a la solución de hipoclorito algun tensioactivo (algunas gotas de detergente de cocina), para que la solución moje bien el explanto. Agita el explante para evitar las burbujas de aire que evitan que la solución llegue a partes del explante. Aún así algunos quedan no estériles. Raro lo de la punta blanca. Generalmente si se dañan, en poco tiempo la parte "quemada" se vuelve negra. Dejalo sólo 10 min en hipoclorito (o menos). No más que eso a menos que el explante sea leñoso. Y después enjuague en agua estéril, claro. Conviene quitar las partes más tiernas porque son las que más se dañan con hipoclorito. Qué planta o plantas estás tratando de propagar? 3. En pocos casos se usan antibióticos ya que lo que más molesta son los hongos. En caso de usar antibióticos tiene que ser alguno autoclavable (no descomponerse) y que no sea fititóxico (que muchos lo son). Algunos usan gentamicina, que s e puede comprar en ampollas inyectables en una farmacia. Buscá la concentración que se usa en in vitro, yo usé hace mucho pero no me acuerdo cual era. Salvo en casos puntuales, no vale la pena. Para hongos muchos usan benomil (o carbendazim), que es autoclavable. No recuerdo la dosis pero es muy baja, no agregar a ojo porque arruinas todo. Buscá referencias. En alguno de los viajes espaciales usaron eso para un cultivo in vitro que llevaron. Hay un producto antihongos y antibacterias )biocida) que es lo que más se usa en cultivo un vitro. Se llama PPM (buscalo en google como Plant Preservative Mixture). Yo lo probé y no es la panacea que parece en la propaganda. Hay publicaciones que dicen que es ridículo gastar tanto en eso cuando el Benomil da mejore resultados y es mil veces más barato. Aún así el PPM es lo que más se usa. 4. Pésimo, no sirve para nada. Conviene usar glovebox. Si no usas glovebox, usa una caja con el frente abierto que puedas pulverizar adentro con solución de 10% de hipoclorito doméstico (50 a 50 gr Cl activo/ L). Y hace todo en un cuarto sin corrientes de aire y movete bien lento y desinfectá todo lo que ingrese en la caja, rociando hipoclorito o alcohol. Con eso no se te contamina. 5. La luz negra tiene UV de longitud de onda larga, cercana al visble. No sirve para esterilizar. Hay que usar una con long de onda más corta. Ayuda, pero es peligroso para la vista y para la piel. Lo más barato es comprar un tubo fluorescente germicida (que no tiene recibrimiento blanco y se monta como cualquier tubo). Aun así es bastante caro (ver) Pero por lo que dije antes no te lo recomiendo, ya que aumenta mucho la cantidad de precauciones que hay que tomar.
A los explantes primeros se les pone la punta blanca que es por la efervescencia del hipoclorito, ahora tienen la punta negra necrosada y se lleno de hongos. Conseguí Iodopovidona que tiene iodo y un polimero llamado polivinilpirrolidona que se usa para evitar que se oxiden los explantes y desinfectarlos, como tambien para los medios de cultivo que no se desarrollen microbios (aunque no se en que concentracion y es "pobre fungicida") y ademas para antisepsia de piel. Yo para esterilizar coloco los explantes en agua corriente con jabón neutro unos minutos, fungicida orgánico 10 minutos, después hipoclorito al 5% por 15 minutos, les corto las puntas con una tijera estéril, los mojo devuelta en un recipiente con agua del grifo y después van para el medio desplazándolos por el cono de esterilización que provoca la hornalla. Aveces los agrego en agua con Bayaspirina C que tiene Acido Acetil Salicilico y Acido Ascorbico para disminuir la oxidacion, pero ahora voy a remplazar todo por la Iodopovidona. Estoy tratando de propagar Frambuesas, según un articulo de micropropagacion invitro en internet.
El iodo es oxidante, como el cloro, no reductor. El ácido ascórbico si es reductor. Pero si haces todo el protocolo de esterilización y después lo enjuagás an agua de grifo, estás volviendo a contaminar el explante. Haciéndolo así nunca te va a quedar estéril ni el explante ni el frasco. Hay algunos que usan concentraciones muy pequeñas de hipoclorito en el medio y con eso lo hacen esteril sin necesidad de tanto protocolo de esterilización. También se pueden esterilizar los frascos en microondas y funciona bastante bien. Cada tanto falla alguno, pero la gran mayoría queda estéril. Nunca probé con moras u otras Rosaceas. Hay plantas que propagan muy fácil in vitro y eso no tiene relación con que sean o no plantas fáciles de crecer. Por ejemplo Lilium es de las más fáciles. No hacen falta hormonas ni nada. Y va muy rápido. Salvia divinorum es difícil de crecer cuando la planta es chica, y la mayoría compra esquejes enraizados y no logra mantenerlos vivos. Pero propagarla in vitro es una pavada. Salvia divinorum, raices y tallos nuevos in vitro Las lentejas, por otro lado, son fáciles de crecer, pero difíciles de propagar in vitro. Si querés pasame un email por mensaje privado y te envío un libro sobre propagación in vitro (en inglés) con detalles para muchas especies.
Muchas gracias por la info, te vuelvo a preguntar, y al estar combinado el iodo con la povidona no disminuye la oxidacion? Sirve el sobre de Bayaspirina C que tiene 200mg de acido ascorbico para sumergir los explantes o hecharle al medio de cultivo? que porcentaje de lavandina le hechas por litro al medio de cultivo para que sea esteril como decis? Y al microondas como haces? porque veo que en internet en los videos rompen la cadena de asepsia... Yo solo estoy interesado por ahora en reproducir frambuesas pero apenas me reciba y agarre algo de dinero voy a reactivar el campo de mis abuelos que esta medio caído abajo y voy a colocar bastantes frutales y ahí voy a propagar bastante, ahora estoy tratando de enraizar unas coniferas pero en tierra nomas, pero me va mal. Y plantas me interesaria tener alguna rara como la mandragora o la salvia o la papaver somniferus, pero solo por el morbo de tenerlas, a mi me interesa mas los frutales. El libro del que me decis tiene algo de eso? De donde sos? Saludos
La povidona es un polímero soluble en agua y lo único que hace es que los cristales de yodo se disuelvan en la solución. La otra forma de hacer una solución de yodo es Lugol también llamado tintura de yodo. Lo que se usa en el Lugol para que el yodo se disuelva es yoduro de potasio disuelto en agua. Y la 3ra forma de hacer tintura de yodo es disolver los cristales de yodo en alcohol común. La diferencia entre yodo-povidona y las otras es que en el lugol o en la tintura el yodo se evapora más rápido de la solución. Te pintas un dedo con tintura de yodo y al rato casi no te queda yodo en el dedo. Mientras que en el yodo-povidona la povidona te va largando el yodo más lentamente, y dura más. Pero la povidona no afecta las propiedades químicas del yodo libre. No uses Bayaspirina C porque es demasiado acetilsalicílico. Esa concentración es tóxica para las plantas. Si necesitas vitamina C barata andá a una tienda de animales o una pajarería y compra un potecito de vitamina C en polvo. O si no, en una farmacia comprá vitamina C en comprimidos no efervescentes que es mucho más barata. (Y recordá que si mezclás una solución de hipoclorito con una de vitamina C, anulás a las 2. El cloro (oxidante) te descompone al acido ascórbico (reductor), y liberás todo el cloro libre. De hecho la forma más ecológica y rápida de sacarle el cloro al agua es poner en una botella de agua una pizca de vitamina C) Sobre hipoclorito en medio de cultivo te puedo mandar una publicación entera sobre cómo usarlo. Sobre propagación de esquejes de coníferas dale una leída al post sobre esquejes que subí hoy: http://foro.infojardin.com/threads/trucos-y-metodos-para-enraizar-esquejes.48719/ El libro que te mencionaba es general sobre cultivo in vitro para que cualquiera lo pueda hacer. Da alternativas para medios de cultivo caseros, etc. Y hay una lista extensa de todo tipo de especies para propagar y cómo hacer con cada una (entre ellas, Rubus /frambuesa). Papaver somiferum la crecés de semilla directamente. Las semillas de adormidera (que aquí en culinaria le dicen semilla de amapola) que te venden en cualquier dietética o casa de repostería son Papaver somniferum y no amapola común roja de campo. O bien la otra es conseguir semillas de variedades más decorativas, o más productivas. Las salvias no las tengo más. Las dejaba afuera y un invierno frío que nevó me congeló las plantas. Estoy acá en Capital. Para esterilizar con microondas: 1. Usar frascos comunes, como por ejemplo frascos de mermelada. No vidrio pyrex porque las microondas no calientan el pyrex, que es transparente a las microondas. 2. Cargar los frascos con el medio de cultivo ya listo, sin tapa. 3. Colocar en los frascos un poquito de arena, o carbón activado molido o cualquier particulita inerte para que el contenido no entre en ebullición de repente y salte todo del frasco. 4. Colocar en horno de microondas hasta que comience a hervir. Una vez que comienza a hervir, parar el horno y darle menos potencia para que hierva más lento (a veces 30-40 es suficiente). Dejar hervir al menos 2 a 3 minutos. 5. Mientras hierve pasarle a las tapas un algodón con solución de lavandina al 10% y dejarlas boca abajo sobre una mesa. 6. Una vez que está terminando el tiempo de ebullición, con un rociador mojás el interior de la tapa con alcohol 96 grados (de farmacia). sin secar ni pasarles nada. 7. Cuando termina de hervir, apenas abrís el microondas colocás la tapa al frasco y cerrás bien. (Usar algun trapo o servilleta de tela! Cuidado porque el frasco va a estar muy, muy caliente!). Y listo.
Muy muy bien! Muchas gracias! El Acido ascorbico no lo consegui en las veterinarias ni tienda de mascotas (no busque mucho) lo unico el redoxon pero es efervesente, aunque esperaria un rato para que se les vaya el efecto efervesente antes de colocarle los explantes. La teoria decia que despues de la lavandina se sumergia en el acido ascorbico para disminuir la oxidacion pero no los dos juntos- En cuanto a las coniferas, tengo IAA al 99% como para tirar manteca al techo, pedi uno soluble en agua pero se ve que me dieron soluble en alcohol porque me quedan las particulas flotando, no se si agregarle alcohol pero puede perjudicar a los esquejes. Pregunte a un farmaceutico para hacerlo en tipo gel bien espeso tipo miel tipo clonex pero me dijo que solo podia hacerlo con carboximetilcelulosa y que es mas tipo gel para cabello y se evaporaba mucho con el calor. En cuanto a las amapola no sabia que las de la dietetica eran semillas del opio, antes que sea ilegal mi abuela tenia sembrada unas y venia un turco y se las compraba cuando crecian. Re inocentes jeje También venden de mandrágora en mercadolibre que vi el otro día. En cuanto lo del microondas entendi todo, cuestion de probar, de todos modos ya pedi un frasco autoclavable de esos chinos para la autoclave. Pasme el libro ese que decís y lo del hipoclorito tambien, me imagino que debe ser al 0,5% para medios de cultivo. Bueno te vuelvo a agradecer y si tenes alguna semilla de plantas misticas que no sea marihuana te lo agradeceria, con algo a cambio por supuesto. Saludos
Pasame por mensaje privado algun email a donde te pueda enviar los libros. Nunca probé ese IBA soluble en agua. Generalmente con esas hormonas, IBA, NAA y BAP siempre el problema es disolverlas. Supuestamente se disuelven en alcohol, y de hecho pude disolverlas con mucha paciencia y entibiando el alcohol, pero después de un tiempo precipita si mantenés la solución en frío. Lo que se hace, y yo también hice al final, es disolverlas en solucion 1 N de hidróxido de potasio (o de última de sodio). Ahi se disuelven muy fácil. (1N de KOH=56g/L ; 1N de NaOH=40g/L). Eso lo tenés como solución stock y lo diluis según la dosis que uses, que en c. in vitro es muy, muy baja. Para esquejes por ahi es mejor diluirlo en polietilenglicol que es medio viscosito (ver Este enlace). Por ahí conseguis un frasquito en alguna farmacia porque es un laxante común. La otra posibilidad es comprar las hormonas de enraizar en gel de Fertifox (estas) (que no sé si son en gel o en polietilenglicol. Y agregarle el IBA ahí para mejorar la formula teniendo la mejor combinacion para enraizar esquejes: IBA + NAA. Las semillas de adormidera (P somniferum) de repostería que venden tienen flor doble color rosa. Son muy lindas. No sé si con lo de in vitro estás haciendo las cosas bien. Lo de la contaminación es bastante crítico. Si enjuagás con solución de vit. C, ¿qué agua estás usando para esa solución? Yo usé vitamina C para Pelargonium en que había mucha oxidación y producción de fenoles. Tanto que el medio de agar me quedaba negro a los 2 días. Pero con vit C evitaba totalmente ese problema: Pero el enjuague final tiene que ser solucion estéril, o perdés todo. Solución estéril quiere decir que tenes que esterilizar el agua, esterilizar en autoclave la vit C en seco (porque si lo hacés en solución se descompone), y disolverla en la caja de guantes en condiciones estériles. Algunos dicen que algo de la vit C queda si la esterilizas en solución pero a mí no me dió resultado. Es muy crítico lo de la contaminación en cultivo in vitro. Si no prestás atención a esos detalles nunca te va a salir y al final te vas a desanimar. Hay otros métodos de micropropagación que toleran bastante más descuidos porque usan medios sin azucar. P ej.: Micropropagación fotoautotrófica. Usa medio de cultivo tipo vermiculita con sales fertilizantes, ambiente cerrado, estéril pero que tolera muchos más descuidos, y con ventilación mediante membranas porosas que permitan enriquecer con CO2. Yo nunca probé pero dicen que es más fácil. Produce menos cantidad de propágulos, pero los que produce se desarrollan y prosperan mejor y más rápido.
La bolsita del IBA dice "IBA+K", me parece que me confundí y lo que queda flotando es el 6BAP, que entonces lo tendría que disolver en alcohol caliente para que se pueda homogeneizar a la solución total(?) Ademas entonces, esterilizo agua destilada en el autoclave y un sobrecito con la vitamina c aparte (caunto miligramos por litro de vit C le estas echando?) Me parece que me voy a tener que improvisar una glovebox nomas, y sino hacerla. Con hipoclorito se descontamina bien la glovebox? Mi viejo tiene Oxido de Etileno y yo en la facultad utilizaba Formalina que es una pastilla de formaldehido que libera gas pero me parece que la prohibieron y el oxido de etileno es bastante toxico... Por ultimo, tenes algun articulo sobre extracción de meristemos? Ahora te paso mi mail. Saludos
IBA+K = sal potásica de IBA (Es lo que se forma cuando agregás IBA a KOH) El BAP no se diluye en agua, en alcohol cuesta y en solucion de KOH se disuelve fácil. Vit C es a ojo porque eso no daña el explante y con la luz se descompone. Calculale 1/4 o algo más de cuch de café en 50-100 ml Te conviene una caja de guantes o algo similar. Hipoclorito doméstico al 10% sobra para rociar y descontaminar la caja.
Bueno a probar entonces, tengo que ir a buscar mas explantes de frambuesa asi que por ahora lo voy a hacer con otra planta que tenga mas a mano, voy a probar con alguna conifera... Despues te cuento y subo fotos.
