Cultivo in-vitro de violetas africanas: intentándolo

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Cultivo de óvulos vegetales y fertilización in vitro

El cultivo de óvulos es una técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo, como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de zigotos y proembriones.

Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi.

Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario.

Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea, Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros.

Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies.

El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil.

Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla.

Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría.

Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar.

Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.

El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar.

Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión.

Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.


A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade.

Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico.

En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos.

Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidas, son las siguientes :


Polinización estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo y polinización in vitro del estigma.

Este tipo de fertilización no requiere ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo.

Se realiza satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.

Polinización placentaria in vitro: En este método se aislan los óvulos con un trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de forma que los óvulos queden expuestos.

De esta forma, se simplifican tanto el medio nutritivo como las manipulación necesaria para el aislamiento de los óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos así como un menor choque hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado.

Esta técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.

En el caso de plantas que sufren aborto de embriones en estadios tempranos del desarrollo y en aquellos cruces en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario, es necesario rescatar los óvulos recién fecundados o incluso fecundarlos in vitro.


Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Y ahí va mi pregunta: "¿Se podrían desinfectar los pedacitos vegetativos en una solución muy diluída de hipoclorito sódico (lejía)?" Es lo que se hace comúnmente con las verduras antes de ingerirlas y tanto es así que existe una lejía de uso alimentario (para los españoles, la he visto en Mercadona).

Las pinzas, tijeras y todo lo que vayamos a usar, se puede esterilizar donde mismo hemos esterilizado los botes. Yo cuando lo he hecho, he atado unos cordelitos al material metálico que lleguen al borde de la olla y cuando los tenga que sacar de la misma después de esterilizados sólo tengo que tirar de éstos. Así no meto la mano en el agua estéril y la contamino... También tengo cuidado de introducir unas pinzas grandes que serán las que me ayuden a manipular los botes sin tener que tocarlos con las manos (y también a ésta le ato un cordel)... ¿Se hacen una idea de a lo que me refiero o no me explico bien?

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Jjejej pues aca le conocemos como cloro y si te ayuda para lo que quieres hacer solo que en pequeñas cantidades yo uso mas el agua oxigenada el cloro o lejoa como le dices solo cuando porngo a desinfectar los frascos y demas ya que el cloro puede contamirar or dentro el material genetico si me paso obiamante jejejeje, en fin aparte las pinzas y otros utencilios que oso antes de tocar cualquies cosa les echo alcohol y les prendo para quecar cualquier cosa asi cuandosolo de rapido y sin que se chichinen, despues ya procedo en la camara de vacio a hacer lo que tenga que hacer, una cosa mas yo por seguridad y añgo mas pues dentro de la camara con un pequeño rosiador les echo mas alcohol a tod para matar lo que me filtre por casualidad.

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

En un artículo que leí sobre violetas in-vitro (no recuerdo dónde, de tanto que he leído últimamente), vi que las ponían en agua con cloro pero que luego repasaban los bordes recortando un poco más para que no hubiera restos de cloro en los pedacitos que se introducían en el medio de cultivo. Repasaban algo así como 1-2mm de cada borde externo para eliminar posibles restos químicos.
Gracias por contestar a mis tontas preguntas. Pero es que soy muy "creativa" y me encanta imaginar con qué otras cosas se podría hacer.
En el medio de cultivo casero, ustedes utilizan los productos que se nombran tal cual o han modificado alguno??? En el medio hablan de tomate, plátano, azúcar, gelatina sin sabor y vitaminas. ¿Valdrían otras frutas? Las vitaminas las añadirán con la mezcla fría, supongo, porque si se añaden en caliente no servirían para nada, ¿no?

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Yo uso un sistema combinado, hago todo en frio y le mesclo ya en caliente para sacar impuresas, tambien he usado medios simples solo para replicar como el agar, complejo vitaminico y abono para orquideas liquido y una poca de hormona vegetal. solo que ese medio requiere mucha luz en el material vegetativo.


El material a reproducir le desinfecto con estirilizante medico o agua oxigenada, el cloro lo e usado muy poco.

Lo malo es que por tiempo es ya menos frecuente cada que hago mis invitro pero ando desde cuendo en comprar el agar ya que estan por salir unas semillas de orquidea hibrida inter especie que me interesa mucho en reproducir asi como clonar las micro violetas que adquiri.

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Solo escribo para comentar una cosa que es las siguiente:
desde el inicio lei todo el post y creo que la iniciativa de Ross fue muy buena incluso la metodologia es buena pero por que no avanzar un poco lo que comenta acurtia es bueno no tiene mucho problema ya que el medio lo venden en sobres para preparar un litro e incluso algunos de los medios ya traen las hormona integradas el costo aproximado de el sobre es de 70 pesos mexicanos y solo se le agrega agua bi o tridestilada que tambien se compra y no es muy cara claro ademas de el azucar y el agar.
asi que si me lo permiten el decir cultivo casero no es sinonimo de rustico se puede mezclar sin la camara de flujo en la caja bien esterilizada y no les tiene que crear ningun problema eso pienso yo espero que este comentario no moleste a nadie no lo hago con la intencion de molestar.
Ruben

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Hola no es malo el comentar es cosa de saber comprender los comentarios, pero dejemos eso solo queria preguntar como esta eso del costo a $70.00 pesos mas o menos me puedes decir bien los datos ya que me intereso por que quiero empezar los invitros de mis micro violetas africanas.....

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

checate la pagina de sigma y ahi trae todos los medios y el precio y tu escoges lo que necesitas oye te pregunto como incorporas las hormonas a tu medio es que a mi se me dificulta mucho el manejo de las hormonas.

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

Si es en polvo es una pisca y si es liquda es una gota durante la mescla de los elementos.!!

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

hola perdon al decir sigma te refieres a la de sigma alimentos o a cual en especifico te agradeceria mucho me sacaras de esa duda por que no supe buscar.

 

Re: Intentando el in-vitro de violetas...

sigma-aldrich