Cultivo in vitro de orquídeas. Preparación del medio y siembra

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Hola Luak,
No, no he usado bicarbonato. Yo uso Hidróxido sódico, pero como te digo debe ser manipulado con extrema cautela. Una salpicadura genera quemaduras muy severas,

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

buen dia chicos.. me e mareado leyendo casi todo el hilo y de seguro me salte paginas.

Me llama la atención la mención del acido abscísico ya que entre mas maduro esta algo, mas presecia hay de este inhibidor. lo que puede haber ser es que como dentro del tomate las semillas estaban germinando habia una produccion de mayor de auxinas o citoquininas. y el acido abscísico no es un inhibidor de desarrollo, es un acelerante de los procesos de maduracion de la planta o fruta y en el caso de semillas su presencia estimularia el desarrollo de las semillas. Las hormonas en general actuan deacuerdo al desarrollo de la planta o la semillas.. asi juegan en contra o a favor de ella.

tengo algunas dudas respecto a las mezclas. las combinaciones que e leido son en su mayoria a base de frutas, pero no se hace mencion de proporciones de estimulandores de desarrollo. La banana, piña , jugo de coco y otros poseen dosis elevadas de citoquininas y son las primeras qeu se descubrieron. pero cuantos miligramos incocientemente se aplica en los medios de cultivo de esta hormona?
tengo citoquininas y auxinas sinteticas, pero no se la proporción a utilizar. Solo en un foro de otras plantas pero para formar cayosidades encontre 2mg de citoquinina por litro y iaa de 0,2mg. me costo ajustar las soluciones madres por lo inestable de las disoluciones, pero para orquideas no encuentro referencias. quizas 2mg por litro sea muy alto para las semillas o quizas no lo sea. por lo menos los medios de cultivo que e hecho sin base de frutas no se han malogrado y ninguno a presentado infestacion alguna. e utilizado la olla a presion a 15 minutos y creo va de lujo.
Ahora probare con material vegetal y la técnica del vapor..
estoy ensayando para cuando me lleguen unas semillas de phalaenopsis que encargué.
Pero no se por que le tengo poca fe a los medios de cultivo a base de frutas, ya que los periodos de germinacion son 50% menores en relacion a estudios de aplicacion hormonal directa en el medio de cultivo...lastima no hace referencia a la relacion de cantidad de cada hormona.

Otra consulta que tengo es donde se consiguen esas tapas plasticas qeu se le ponen a los colados. http://www.phytotechlab.com/Detail.aspx?ID=1134 por mas que busco en ebay no pillo y encargarla directo a ellos me sale 400 dolares solo el envio.. es una cantidad aberrante.

desde ya agradesido por tanta informacion que este hilo a dado desde el 2009 segun recuerdo.

esperare ancioso respuesta. aca el agar es facil de encontrar y de buena calidad de solidificacion 6 dolares los 100 gramos y eso alcansa para mucho...

saludos desde chile.

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

La siguiente imagen es el rango del PH que indica dependiendo el valor, como los minerales se abosorben en mayor o menor grado dependiedo también de la preferencia de las plantas.



Por eso es importante ajustar el PH en el medio de cultivo in vitro. Yo personalmente nunca lo ajustaba (hasta la semana pasada) como tal porque mis fórmulas son caseras con fertilizantes , pero utilizo aproximaciones según mis conocimientos empíricos que me han funcionado:
Cuando utilizo agua de coco, añado unas cuantas gotas de limón al medio (acidifico) y cuando utilizo piña y papa, añado unos 3 gramos extras de ázucar ('neutralizo' la acidez), pero también altero la concentración de gelificante a 0.5 gramos extra. Esto último les puede funcionar igual para el tomate.
Nunca he probado, pero he leido que el plátano es inhibidor de germinación para algunas Phalaenopsis, Paphiopedilums y Cipripediums. Por eso el tomate y sobre todo el plátano, nunca lo incluyo en la elaboración de mis medios.

(Más información sobre el PH en http://es.wikipedia.org/wiki/PH.)

Como afirma eliseoteson, el PH se ajusta con Hidróxido sódico, midiendo de preferencia con medidor de PH o en su defecto un buen papel PH que no da resultados tan exactos.
Si utilizan otras sustancias (que es válido) pueden tardar muchas pruebas y errores tratando de encontrar el equilibrio adecuado, pero si encuentran el ajuste perfecto favor de indicarlo con fotografías para ver como germinan y se desarrollan las semillas/plántulas.

Si utilizan la fórmula de Knudson C, ésta no lleva fitohormonas, aunque si gustan las pueden añadir.
Si utilizan la fórmula de Murashige & Skoog para cultivar tejidos, la concentración de fitohomonas las pueden encontrar en:
http://en.wikipedia.org/wiki/Murashige_and_Skoog_medium
Ese es el mejor referente para la concentración de tales compuestos.

¿Se han preguntado porqué germinan las semillas en la mezcla del tomate/plátano?

Una alta concentración de Potasio es la que hace el origen de la germinación para muchas orquídeas epífitas. Sí, definitivamente hay mucho nitrógeno y otros compuestos, pero el potasio es un elemento muy abundante en el tomate y el plátano. Y si se trata de compuestos químicos, tan sólo revisen las formulaciones de Knudson y Murashige y verifiquen el contenido de potasio en ambas.

El asunto del ácido absísico y las fitohormonas en el tomate, yo lo pondría de lado (mi punto de vista). Nunca podremos saber con exactitud cuantas fitohormonas contiene la pulpa de cada fruta, porque como comentó Acourtia en algunos post anteriores, 'eso depende del grado de maduración, la temporada del año y la nutrición de la planta' y eso además varia de región en región de forma gigantesca.

arcangell: Las famosas tapas 'magenta vessels' las puedes comprar en tu país:
http://www.phytotechlab.com/Distributors.aspx#CHILE

Saludos

 

Tomare en cuenta el consejo del potasio ya que justamente hay semillas de Paphiopedilums. Yo e usado tiras se papel y para ajustar el ph uso acido cítrico que además es preservante.
E escrito a la
Dirección de Chile, mandado Correos y llamo y simplemente no contestan. Me frustra ya que quiero aprender. Con ustedes se aprenden mucho

En la formula MS aparece solo un rango de contenido hormonal posible que es bastante amplio y las combinaciones son demasiadas como
Para hacerlas en casa.

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Gracias de nuevo gerardin....

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

El ácido cítrico se encuentra en el limón, por eso yo utilizo el jugo y me ahorro en compuestos químicos. Además el limón contiene inositol que a pesar que está presente en cantidades ínfimas, funcionan a la perfección.

¿Has intentado llamar telefónicamente?

Si no contestan el teléfono, prueba con Sigma Aldrich ellos también venden los productos Magenta. Busca en el catálogo de Sigma las 'Magenta Caps'

No te ahogues en un vaso de agua.
La respuesta podria ser más sencilla de lo que parece.
Aquí en el foro por ejemplo una gran cantidad de personas utilizan Benerva de Bayer, vitamina B1 para consumo humano para aplicarlo a las orquídeas.
¿Qué sucedería si en lugar de utilizar la Benerva utilizamos un compuesto complejo que además de contener la vitamina B1 y otras vitaminas esenciales para las plantas, contiene fitohormonas y macro y micro elementos?
Suena mejor, ¿No?

Yo por eso utilizaba fertilizantes foliares tanto para alimentar a las plantas adultas, como para mis cultivos in vitro. Me evito problemas de combinar fitohormonas en las cantidades que me indica una fórmula y lo peor de todo es que evito comprarlas de forma aislada ya que resultan algo caras y no siempre las empresas químicas las tienen en existencia, todo es sobre pedido y a esperar varias semanas.

Buscate en tu tienda de productos agroquímicos más cercano un producto que contenga los compuestos que necesitas. Lee la etiqueta y decide. A tu medio de cultivo añade el producto a gotas. Eso funciona.

Si el reproducir orquídeas para vender es tu negocio, olvida la sugerencia e invierte en productos ultrapuros de laboratorio aquí las fórmulas caseras no tienen cabida.

Cuando me refiero a 'utilizaba fertilizantes', es que ahora uso compuestos químicos de laboratorio por las pruebas de cultivo de tejidos que voy a llevar a cabo y aquí debo evitar la 'prueba-error' e ir a la segura. No conviene perder el tiempo con fórmulas caseras cuando se busca un resultado seguro y confiable.

Espero la información sea de utilidad.

Saludos

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Yo uso ácido clorhídrico, o lo que es lo mismo, "aguafuerte" o "salfumánt", para bajar el ph. Y "bicarbonato sódico" para subilo. En mi corta experiencia, me funciona bién.
Cuando llueve almaceno el agua de lluvia en un bidón de 50 litros, la cual uso para regar las orquídeas. Como éste agua tiene un ph sobre 7, uso aguafuerte para bajarlo a 5,5-6. Si me paso, uso bicarbonato para subirlo. Tras un tiempo (15-20 días), vuelvo a medir el ph y apenas ha variado (0,1-0,2).

Un saludo

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Es que no se puede dar por cierto todo lo que se lee por hay, gracias por la info.....

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra


Hola, para los que todavía no se animan a sembrar semillas a partir de cápsulas secas y que tienen precaución o miedo a la contaminación, aquí les muestro algunas fotos:

Semillas de una cruza de Blc. compleja. Desafortunadamente no hubo semilla fértil. La desinfección se realizó con Hipoclorito de Sodio (Lejía, Cloro) y un tiempo de desinfección de 5 minutos, realizando 5 enjuagues con agua estéril sobre papel filtro y sembradas con espátula estéril.
De 7 frascos sembrados no hubo ningúno contaminado. Los frascos llevan poco más de un mes y estan listos para ser descartados debido al fracaso en la fertilidad de las semillas. El aumento de la lupa es 20X





Semillas que sembré el Sábado pasado por la tarde (sólo 2 frascos con pocas semillas), se trata de una Encyclia cordigera a partir de cápsula seca.
La desinfección se realizó con Hipoclórito de Calcio y un tiempo de desinfección de 20 minutos. No realicé ningún enjuague. Igualmente las semillas se colocaron sobre papel filtro y se sembraron con espátula estéril.
desde el Lunes (ayer) por la tarde, ya se veían signos de germinación.
Lupa con aumento de 20X



Otra vista de la misma siembra pero con lupa 5X, noten el reflejo de la luz en la lupa, la ventana tiene una persiana vertical. Me ahorro el gasto de utilizar lámparas. La ventana se abre todos los días y los frascos no se contaminan por el flujo de aire.
La temperatura diurna en estos momentos es de 20C, a las 4PM alcanza los 25-30C y por la media noche-madrugada baja a 15C. Para mediados de Verano, la temperatura permanece un poco más cálida y a la vez más húmeda. En Otoño-invierno es todo lo contrario y para esas fechas los frascos cambiarán de residencia.



Mis medios de cultivo anteriormente contenian fertilizantes, hoy día son Knudson C, adicionados con pulpa de manzana, pera, zanahoria y agua de coco (sólo 2 frutas a la vez, dependiendo de la prueba) y un poco de jugo de limón

Desde la aparición de un virus en mi colección (y la debida eliminación de la planta), no he vuelto a sembrar nada a partir de semillas verdes, es un verdadero riesgo, al menos en México por los casos que conozco de esta plaga (son 3 virus los que ha identificado la UNAM en los distintos viveros. Reporte no oficial).

Por cierto si un alma caritativa tiene para obsequiar semillas de Rossioglossum grande, yo las recibo con todo gusto. No he podido encontrar quien me venda un ejemplar.
Lo que ya conseguí es un Rosioglossum insleayii que tardé 6 años en conseguirlo, es muy escaso y es una especie amenazada. Hay que reproducirla para reintroducirla al bosque!!

La foto de la planta en: http://www.orchidspecies.com/rossinsleayi.htm

Saludos.

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Buenas a todos, estoy preparando un cultivo de terrestres y no se si germinarlas en la oscuridad o en la luz.....que me decis....gracias de antemano....saludos.

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Deja la mitad de los frascos en total oscuridad y la mitad con luz... nunca se sabe... hay especies con las que se obtiene excelente germinación con luz y otras no germinan bien si no es con oscuridad...
Una persona que sabe mucho (XGdL) dice que "sospecha que el factor fundamental en ese aspecto es la composición del medio".
Mi experiencia personal es que además de eso uno de los factores clave con las terrestres es la cantidad de agar a usar... (usa muy poco o ninguno y transfiere inmediatamente una vez que los PLB's se hayan formado).

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Hola, consulta de re principiante:
*los frascos 20 minutos en la olla a presión, no se rompen? podría se en una olla común?
*al usar agar agar y estar el mismo a elevadas temperaturas, ese líquido queda como una gelatina que después por encima se les pone las semillas, entendí bien? Gracias y excelente todo

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Hola ISAGDC!! Bienvendo al foro!! Basta con 5 min despues de que comienza a silvar la olla de presión, pero si tienes tus dudas hasta 8 mins, los frascos se dejan abiertos y se tapan con aluminio para dejarlos enfriar y solidificar dentro de la olla, pues si los cierras aún calientes sin solidificar guardan presión negativa y cuenta mucho abrirlos.
En cuanto a plantar las semillas, así es solo debes dejar solidificar y esperar a temperatura ambiente almenos 5 días sin sembrar nada para verificar que tu medio de siembra no tiene contaminación o vas a arruinar un lote de semillas!!


SAUDOS!!

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Netpiolin envíame tu dirección de correo, tengo información que te puede interesar.

Eliseoteson, aún no compro el químico para poliploídia, pero ya encontré quien vende el producto en la ciudad.
También tengo algunos datos que te enviaré posteriormente, en cuanto acabe de leer y asimilar la información para comentarla te lo envío.

ISAGDC: Puedes utilizar menor tiempo de esterilización, pero a menor tiempo, mayor riesgo de que esporas de hongos sigan vivas. Por eso se recomiendan los 20 minutos. Si utilizas menos tiempo, podrías optar mejor por una 'pasteurización' (https://es.wikipedia.org/wiki/Pasteurización), cierras los frascos, la olla con muy poca agua, enciendes la estufa y apagas en 5 minutos. Cuando baje la presión de la olla y los frascos se puedan agarrar con la mano, todavía ligeramente calientes sin quemar, pasalos por agua muy fría, con hielos.
Como dice Zarq, no podrás evitar la presión negativa y en ese caso es mejor utilizar cámara esteril o campana de flujo laminar para la siembra.
De hecho no es necesaria la olla de presión, basta con una buena esterilizacón con baño maría en olla con tapa.

Los frascos no es necesario que lleven su tapa original como el procedimiento que religiosamente muchos siguen al pie de la letra.
Si has leido sobre los experimentos de Louis Pasteur sobre el matraz con cuello de cisne tendrás una mejor idea al respecto:

http://nutrileft.files.wordpress.com/2012/12/20070417klpcnavid_259-ees-sco.png?w=300&h=237

http://www.dmae.upm.es/Astrobiologia/Curso_online_UPC/capitulo9/2.html


La desventajas de las tapas del frasco herméticamente cerradas es que evitan el intercambio gaseoso (entrada de CO2 y salida de O2 y otros gases), el flujo de aire al interior del frasco (principalmente CO2) ayuda al mejor desarrollo de las plántulas (luz + CO2 + ázucares y almidones y otros compuestos del medio= fotosíntesis, mejor desarrollo, mayor crecimiento).

Las tapas plásticas como las 'Magenta Caps', a pesar de que aparentan estar completamente cerradas, permiten una pequeña cantidad de intercambio gaseoso con el exterior y eso es muy beneficioso.

Yo hace unos 18 años atrás llegué a utilizar tubos de ensaye para mis cultivos y cubria su boca con un capuchón como tapa hecha de papel aluminio de 10 cm de largo y nada más. Nunca obtuve contaminación por mis drástico métodos para esterilizar, pero el agar perdía agua al cabo de 2 meses y opté mejor por cubrir mis frascos con plástico adherente. El plástico adherente no evita al 100% el hermetismo y permite el intercambio gaseoso del exterior al interior y visceversa, provocado principalmente por los cambio de temperatura que son beneficiosos para las plántulas en desarrollo:







No se alcanza a ver muy bien, pero por el borde visible de la boca vidrio en el frasco más pequeño y el de enmedio, no contienen ninguna tapa, sólo el papel aluminio y plástico adherente. El 3er frasco es comprado (las plántulas tenían hojas muy delgadas y pseudobulbos poco o nada desarrollados, pero después de poco más de 3 meses de luz solar mejoraron notablemente) pero también lleva plástico adherente en cinta alrededor de la tapa.
En cuanto a crecimiento, las plántulas de Encyclia cordigera (frasco pequeño con mis semillas) y las Cattleyas del frasco de enmedio que mi amigo Roberto Serpa me entregó, deben alcanzar o superar el tamaño de las plántulas de Laelia del frasco comprado y no es díficil lograrlo cuando el medio de cultivo, replantes y las condiciones son las óptimas.

Si el procedimiento de esterilización de frascos es el adecuado, no necesitan esperar 5 días para sembrar.
Yo esterilizo a las 10:40PM y dejo enfriar la olla por la noche, y al día siguiente entre 5 y 6 AM, antes de mis actividades rutinarias comienzo la siembra de inmediato y nunca he tenido problemas de contaminación.
La contaminación viene por la pésima manipulación de los frascos o por la mala desinfección/manipulación de semillas/cápsulas.

Para los que argumentan que con el medio de Knudson C/Murashige & Skoog no son necesarios tantos replantes, les comento que puede funcionar, pero no es lo óptimo (lo mismo se aplica para los medios caseros).
De hecho en Phalaenopsis se requieren al menos 3 a 4 replantes para obtener un óptimo desarrollo de las plántulas. Aunque hoy día con las ténicas actuales en los viveros comerciales modernos, los gelificantes ya no se utilizan y los replantes suscesivos ya no se se llevan a cabo, son cosa de la prehistoria. Con los métodos modernos las plántulas bien desarrolladas salen del frasco en máximo 6 meses. Por eso Dendrobiums y Phalaenopsis en algunos viveros se venden comercialmente con máximo 2 años de crecimiento total contados a partir de la siembra in vitro y ya con floración.

Otro dato interesante que encontré es la composición química del agua de coco:

www.mdpi.com/1420-3049/14/12/5144/pdf‎

Y como lo dije anteriormente, el Potasio es uno de los compuestos más importantes y en mayor cantidad (después del Nitrógeno) para la germinación de las semillas, al menos en epífitas.
Por eso algunas plántulas llegan a florecer in vitro. El Potasio entre otras cosas provoca la floración, mientras el Fósforo ayuda entre otros procesos a la producción de semillas en plantas maduras. Es una mentira que el Fósforo es el responsable de la floración en las plantas, el dato está corroborado con reportes de las estaciones agroexperimentales que he leido de la Universidad Estatal de Florida, Minessota y libros de agricultura/ cultivo de ornamentales en algunas bibliotecas.

Tenía el enlace también de la composición química del tomate, pero no la encuentro, se las debo.

Luak, si te sirve el dato, muchas terrestres y algunas semiterrestres, incluyendo Cypripediums y algunos Paphiopedilums requieren total obscuridad para germinar, pero el plátano añadido al medio no es el mejor amigo de ellas. Hay dos artículos en la revista Orchids de la AOS que habla al respecto (obscuridad y plátano), posiblemente lo puedas encontrar googleando, son ediciones de principios de los 90's.
Los medios óptimos de siembra para las terestres como se comentó un poco atrás en este hilo, son:
Almidones, Carbón activado y aminoácidos de tubérculos y un poco de pulpa de fruta. Nunca utilices Nitrógeno químico. El gelificante sustituyelo o compra agar de la mejor calidad posible (bacto agar o peptona que es más económica o busca otro sustituto).

Y por último, para cerrar mis comentarios, ¿Alguién ha utilizado 'Chitosan' para sus cultivos in vitro?
Me parece interesante tener alguna referencia no comercial o científica para comparación de aditivos de siembra con otros medios.

Saludos

 

Re: In vitro I y II. Preparacion del medio y siembra

Gracias Gerardin, menuda base de datos estas hecho.....saludos.